His-tag蛋白纯化磁珠

BeaverBeads™ His-tag Protein Purification磁珠(组氨酸标签蛋白纯化琼脂糖磁珠)是专为高效、快速纯化组氨酸标签蛋白而设计的一种新型功能化材料,可通过磁性分离方式直接从生物样品中一步纯化出高纯度的目标蛋白,显著地简化了纯化工艺,降低了设备需求,适合科研和工业领域便捷快速地进行组氨酸标签蛋白的纯化工作。

对比传统的过柱层析纯化方式, His-tag Protein Purification磁珠通过磁性分离方式纯化组氨酸标签蛋白,无需对粗蛋白样品进行多次费时费力的离心、过滤步骤,无需装柱和过柱层析,无需昂贵的柱层析设备,在1小时内便能便捷地获得高产量和高纯度的目的蛋白,且能轻松实现多样品平行处理,显著提高了工作效率,大大降低了设备、时间和人工成本.

本产品系列包括镍离子(Nickel)和钴离子(Cobalt)两种金属离子螯合磁珠。它们在目标蛋白结合量及所得目标蛋白纯度上有所差异,一般推荐客户使用镍离子螯合磁珠,大多数情况下能满足客户对蛋白载量和纯度的要求;对纯度要求更高的客户推荐使用钴离子螯合磁珠。

His-tag Protein Purification磁珠广泛适用于细菌、酵母、昆虫和哺乳动物细胞等分泌或胞内表达的可溶性组氨酸标签蛋白以及变性蛋白的纯化。

产品名称 编号 规格 包装 单价 加入购物车
BeaverBeads™ IDA-Nickel 70501-5 10%(v/v) 5mL ¥1000.00
BeaverBeads™ IDA-Nickel 70501-100 10%(v/v) 2x50mL ¥5000.00
BeaverBeads™ IDA-Nickel 70501-1000 10%(v/v) 4x250mL ¥30000.00
BeaverBeads™ IDA-Cobalt 70502-5 10%(v/v) 5mL ¥1000.00
BeaverBeads™ IDA-Cobalt 70502-100 10%(v/v) 2x50mL ¥5000.00
BeaverBeads™ IDA-Cobalt 70502-1000 10%(v/v) 4x250mL ¥30000.00
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1.可从粗样品直接纯化目标蛋白,极大的缩短纯化时间

2. 可轻松实现对目标蛋白浓度和体积的控制

  • 通过调节洗脱缓冲液体积的方式,实现对目标蛋白浓度和体积的控制,无蛋白损失,且不存在蛋白变性、沉淀的风险。

3. 一步纯化即可获得高纯度目标蛋白

海狸磁珠与市场上进口产品相比,一步纯化即得到同水平高纯度的目标蛋白。一个完整的操作流程即可获得纯度可以达到95%以上的目标蛋白。

 

4.平行操作稳定性高,可方便实现高通量和大规模蛋白纯化

  • 目的蛋白纯度和产量的标准差均<5%。
  • 完全不存在流速和样品体积的限制,适用于高通量和大规模蛋白纯化。

5.可以获得较高的目标蛋白产率

  • 利用海狸磁珠对粗样品进行纯化,一步完整的纯化流程之后,90%以上纯度的目标蛋白,其产率一般达到70~80%。

6.可重复使用,再生工艺简单

  • 由图A、B可知,海狸磁珠反复进行多达六次再生处理,仍能保持较好的目标蛋白结合能力和纯度。

      图A. 再生6次后磁珠结合目标蛋白检测图谱              图B. 再生6次后磁珠的蛋白结合量数据图

 7. 镍螯合磁珠与钴螯合磁珠对不同分子量的His-tag蛋白纯化对比

  • Co离子螯合磁珠蛋白结合量比Ni离子螯合磁珠稍低,但纯度更高;
  •  Co离子螯合磁珠洗涤和洗脱所用咪唑浓度都比Ni离子螯合磁珠低。

         图A.镍和钴螯合磁珠纯化His-tag Lif 蛋白                          图B.镍和钴螯合磁珠纯化M-MLv蛋白

                  (分子量~ 50KD)对比                                                    (分子量~ 70KD)对比

 

 

引用文献:

  1. Overexpression of a cysteine proteinase inhibitor gene from Jatropha curcas confers enhanced tolerance to salinity stress;ELECTRONIC JOURNAL OF BIOTECHNOLOGY  卷: 18   期: 5   页: 368-375   出版年: SEP 2015
  2. Production and Stabilization of an Integrin Binding Moiety of Complement Component 3;MOLECULAR BIOLOGY  卷: 49   期: 5   页: 723-727   出版年: SEP 2015
  3. The role of semaphorin 4D as a potential biomarker for antiangiogenic therapy in colorectal cancer;ONCOTARGETS AND THERAPY  卷: 9   页: 1189-1204   出版年: 2016
  4. 血红铆钉菇免疫调节蛋白基因克隆及其生物信息学分析和重组表达;沈阳农业大学学报 
  5. Innovation Spaces in Asia: Entrepreneurs, Multinational Enterprises and Policy;
  6. 登革病毒四型联合重组包膜蛋白III 区的表达和免疫原性鉴定*;中国生物工程杂志 
  7. Quantitative Proteomic Analysis of Escherichia coli Heat-Labile Toxin B Subunit (LTB) with Enterovirus 71 (EV71) Subunit VP1;INTERNATIONAL JOURNAL OF MOLECULAR SCIENCES  卷: 17   期: 9     文献号: 1419   出版年: SEP 2016
  8. 人C-Src 蛋白酪氨酸激酶真核表达, 纯化及活性检测;生物技术通报 
  9. 人酪氨酸蛋白激酶Lyn的真核表达、纯化及鉴定;生物技术 
  10. 一个麻风树Kunitz型蛋白酶抑制剂基因的克隆和鉴定;四川大学学报(自然科学版) 
  11. 锌离子依赖金属蛋白酶1(Zmp1)抑制小鼠RAW264.7细胞增殖以及吞噬体-溶酶体的融合;细胞与分子免疫学杂志 
  12. A Novel Assay for Screening Inhibitors Targeting HIV Integrase LEDGF/p75 Interaction Based on Ni2+ Coated Magnetic Agarose Beads;SCIENTIFIC REPORTS  卷: 6     文献号: 33477   出版年: SEP 16 2016
  13. Eukaryotic expression,protein purification and identification of human tyrosine-protein kinase Lyn;
  14. The role of semaphorin 4D as a potential biomarker for antiangiogenic therapy in colorectal cancer;ONCOTARGETS AND THERAPY  卷: 9   页: 1189-1204   出版年: 2016
  15. Design, Recombinant Fusion Expression and Biological Evaluation of Vasoactive Intestinal Peptide Analogue as Novel Antimicrobial Agent;Molecules 2017, 22, 1963; DOI:10.3390/molecules22111963
  16. The thermoduric effects of site-directed mutagenesis of proline and lysine on dextransucrase from Leuconostoc mesenteroides 0326;International Journal of Biological Macromolecules,DOI:10.1016/j.ijbiomac.2017.10.023
  17. GR1-like gene expression in Lycium chinense was regulated by cadmium-induced endogenous jasmonic acids accumulation;Plant Cell Rep (2017) 36:1457–1476, DOI:10.1007/s00299-017-2168-2
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70501-02 His-tag标签蛋白纯化磁珠说明书.pdf

His-tag蛋白纯化篇
1.蛋白不吸附或亲和力低
首先确认纯化前的样品中是否有目标蛋白。
(1)有目标蛋白,但大量穿透:
a、蛋白不含有标签或未能正确表达
解决措施:Western Blot鉴定目标蛋白是否有His-Tag。若没有,需要重新构建载体,添加组氨酸标签,并确认标签正确表达。
b、蛋白折叠导致组氨酸标签未完全暴露
解决措施:
在不变性条件下纯化蛋白,在样品和平衡缓冲缓冲液中加1-2M尿素,这样蛋白结构相对松散,而蛋白不会变性。
在变性条件下纯化蛋白,加入4~8M尿素或4~6M盐酸胍使蛋白变性。如果蛋白有二硫键,最好加1-2mM DTT或1~5mM巯基乙醇(在样品中添加),可以改善蛋白的吸附。
重新构建载体,将组氨酸标签换到另外一端,或在组氨酸标签基因与目的基因之间增加一段Linker,可以降低蛋白折叠后标签被掩盖的几率。
c、标签太短  
解决措施:将标签的组氨酸数量增加至6-10个。
d、蛋白标签被水解
解决措施:添加合适的蛋白酶抑制剂;尽量在低温下处理样品;对于分泌表达的蛋白,长时间存放将增加蛋白被降解的风险,应尽快处理样品。
e、蛋白溶解度偏低或聚集
解决措施:在结合缓冲液中添加0.5%-1% Tween-20、Triton X-100,或5%~50%的甘油,可以增加蛋白的溶解度,减少蛋白聚集。
f、样品及结合缓冲液不合适
解决措施:确认样品及缓冲液中不含有EDTA、还原剂等。另外,将样品及结合缓冲液pH调节至7.4~8.5,有利于蛋白结合。
(2)有目标蛋白,但含量很低:
蛋白表达量低。解决措施:对样品进行浓缩,增加磁珠用量、延长反应时间;优化表达条件(诱导剂浓度、诱导温度、诱导时间,培养基等);或更换其他合适的表达载体或表达系统。

2.纯化得到的蛋白量少
(1)磁珠用量不足。本产品磁珠悬液浓度为10%,对于亲和力较高的蛋白,每毫升磁珠悬液可结合的蛋白量约为3~4mg。用户需要根据目标蛋白含量,使用足够量的磁珠。对于亲和力较低的蛋白,需要增加磁珠用量,延长反应时间,或提高样品及结合缓冲液pH。
(2)蛋白与磁珠亲和力较低。参考问题1。
(3)蛋白浓度低。对样品进行浓缩,或增加磁珠用量、延长反应时间。
(4)磁珠重复使用次数太多。将磁珠进行再生处理(参考产品说明书)。

3.洗脱产物杂带多什么原因?怎么处理?
(1)杂蛋白吸附。由于组氨酸,色氨酸,半胱氨酸等是蛋白质中很常见基团,而蛋白折叠可能导致几个这样的氨基酸残基临近,这样也会使它们和磁珠的作用力增加。可以用不同浓度的咪唑进行梯度洗脱,在样品及平衡缓冲液中添加0.5%吐温或Triton X-100,或5~50%的甘油,可以避免因为疏水相互作用导致非特异吸附,或使用钴离子螯合磁珠(BeaverbeadsTM IDA-Cobalt)。此外,要获得纯度较高的蛋白,需要对裂解、结合缓冲液、洗涤缓冲液、洗脱缓冲液的组分、pH、咪唑浓度等进行优化。若还是不能获得高纯度的蛋白,则需要考虑使用多步纯化,结合使用离子交换、凝聚过滤等纯化方法。
(2)菌体破碎条件太剧烈导致蛋白断裂。确保在冰浴条件下破碎;降低超声破碎的强度,缩短时间;适当稀释样品,添加核酸酶,降低样品粘稠度。
(3)蛋白被部分水解。添加合适的蛋白酶抑制剂,并尽可能在低温下操作。

4.目标蛋白难洗脱
穿透组分中目标蛋白明显减少,而洗脱组分中目标蛋白很少,取少量磁珠加SDS-PAGE Loadding Buffer于95℃加热5~10min,离心跑电泳,如果发现较多蛋白残留。
(1)洗脱调节太温和。提高洗脱液咪唑浓度至700mM还不能洗脱时,可以尝试降低洗脱液pH至4.0,但低pH会也导致金属离子脱落,磁珠需要再生后再使用。
(2)蛋白吸附在磁珠上无法洗脱。对于非特异性疏水吸附的蛋白,可以增加NaCl浓度至1M,或添加0.1%~2%的Triton X-100洗脱。对于聚集沉淀在磁珠上的蛋白(尤其注意含有二硫键的蛋白),可以在洗脱缓冲液中加入6M盐酸胍进行变性洗脱。

5.磁珠再生后,蛋白纯化效果变差怎样改善?
(1)再生过程的碱处理可以改善再生磁珠的蛋白纯化效果,参考海狸生物医学《组氨酸标签蛋白纯化亚博在线》说明书中磁珠再生部分步骤4。
(2)重新挂金属离子后为清洗干净,需要增加洗涤步骤。残留的金属离子优先跟蛋白结合,影响蛋白与磁珠的结合。

6.缓冲液中咪唑添加的意义
(1)结合缓冲液中低浓度的咪唑是为了减少杂蛋白的非特异性吸附;
(2)洗涤缓冲液中低浓度咪唑是为了吸取吸附能力较弱的杂蛋白;
(3)洗脱液中高浓度咪唑是为了洗脱目的蛋白。

7.IDA-镍和IDA-钴的区别
IDA-镍的蛋白载量高,40mg/mLgel,纯度稍低,纯度有90%。
IDA-钴的蛋白载量稍低,25mg/mLgel,纯度达到95%。
一般客户建议购买IDA-镍磁珠,即可达到目的。

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